中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)在血栓形成中的作用及檢測技術(shù)進(jìn)展

內(nèi)容簡介：
中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）是中性粒細(xì)胞激活后釋放的以DNA和組蛋白為核心的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其在天然免疫中扮演防御角色，但其過度形成與病理性血栓形成密切相關(guān)。本文聚焦于NETs在動脈粥樣硬化、深靜脈血栓及相關(guān)凝血病中的最新研究進(jìn)展。重點介紹了針對NETs標(biāo)志物（如瓜氨酸化組蛋白H3 Citrullinated Histone H3, Cit-H3）的特異性免疫熒光、免疫組化及ELISA檢測技術(shù)的原理與應(yīng)用。文章詳細(xì)闡述了如何利用高特異性的抗Cit-H3（如Abcam抗體的克隆號RM913）等抗體，在組織切片和血漿樣本中精準(zhǔn)識別并定量NETs，并討論了多種檢測技術(shù)聯(lián)用（如Sytox Green DNA染料與抗體共標(biāo)記）在提升檢測特異性方面的策略，為研究血栓炎癥提供了關(guān)鍵方法學(xué)支持。

關(guān)鍵詞： 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）、瓜氨酸化組蛋白H3（Cit-H3）、免疫組織化學(xué)、血栓形成、免疫熒光

正文：

中性粒細(xì)胞是人體先天免疫系統(tǒng)的第一道防線，傳統(tǒng)上被認(rèn)為主要通過吞噬作用、脫顆粒和產(chǎn)生活性氧來清除病原體。2004年，Brinkmann等人發(fā)現(xiàn)了一種全新的中性粒細(xì)胞抗菌機(jī)制——中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）。NETs是由活化的中性粒細(xì)胞釋放的由染色質(zhì)DNA纖維、組蛋白和大量顆粒蛋白（如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶NE、髓過氧化物酶MPO）組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠有效捕獲并殺滅細(xì)菌、真菌和病毒。

NETs的形成（又稱NETosis）是一個活躍的細(xì)胞生物學(xué)過程，依賴于活性氧（ROS）的產(chǎn)生、肽基精氨酸脫亞胺酶4（PAD4）的激活以及后續(xù)的組蛋白瓜氨酸化。其中，組蛋白H3的精氨酸殘基在PAD4作用下轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，即瓜氨酸化組蛋白H3（Citrullinated Histone H3, Cit-H3），是NETs形成的一個關(guān)鍵性生化事件和特異性標(biāo)志物。

然而，正如一把，不受控制的NETs釋放也會對宿主組織造成嚴(yán)重?fù)p害。近年來，大量研究表明NETs在病理性血栓形成中扮演了至關(guān)重要的角色。在動脈粥樣硬化斑塊中，NETs成分可以促進(jìn)血小板活化、聚集，并作為支架加速血栓的形成。在深靜脈血栓（DVT）模型中，NETs被證實是血栓結(jié)構(gòu)的核心組成部分。特別是在重癥患者中，大量NETs的形成被認(rèn)為是導(dǎo)致其高凝狀態(tài)和致命性微血栓的重要原因之一。

因此，準(zhǔn)確檢測和定量組織及循環(huán)系統(tǒng)中的NETs，對于理解血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)新的生物標(biāo)志物和治療靶點具有重大意義。由于NETs是復(fù)雜的混合體，其檢測需要多管齊下的策略，而基于抗體的免疫學(xué)檢測技術(shù)因其高特異性和靈敏度成為其中的。

1. 免疫熒光顯微鏡技術(shù)：
這是可視化NETs的“金標(biāo)準(zhǔn)"。通常采用共聚焦顯微鏡對細(xì)胞或組織切片進(jìn)行多重?zé)晒鈽?biāo)記。

• DNA染料：如DAPI、Hoechst或細(xì)胞不透性的Sytox Green/Orange，用于顯示NETs的DNA骨架。

• 抗組蛋白抗體：如抗組蛋白H3抗體，用于標(biāo)記DNA上的組蛋白核心。

• 抗特異性NETs標(biāo)志物抗體：這是區(qū)分NETs與單純壞死細(xì)胞釋放的DNA的關(guān)鍵。抗瓜氨酸化組蛋白H3（Cit-H3）抗體是目前最特異的標(biāo)志物之一。高特異性的抗Cit-H3抗體（例如，經(jīng)過精心驗證的兔單克隆抗體）能清晰地標(biāo)記出發(fā)生瓜氨酸化的組蛋白，從而將真正的NETs結(jié)構(gòu)與其它細(xì)胞外DNA區(qū)分開來。通常還會共標(biāo)MPO或NE，以進(jìn)一步確認(rèn)。
  結(jié)果判讀：當(dāng)Cit-H3陽性信號、MPO/NE陽性信號與DNA絲狀結(jié)構(gòu)共定位時，即可確認(rèn)為NETs。

2. 免疫組織化學(xué)技術(shù)：
對于石蠟包埋的臨床組織樣本（如動脈斑塊、血栓標(biāo)本），IHC是研究NETs空間分布與疾病病理關(guān)聯(lián)的強(qiáng)大工具。同樣，使用抗Cit-H3抗體進(jìn)行IHC染色，可以在復(fù)雜的組織微環(huán)境中特異性地定位NETs沉積的區(qū)域，并通過與血小板（CD41/CD61）、纖維蛋白等血栓成分的共定位分析，揭示其相互作用。

3. 酶聯(lián)免疫吸附測定：
對于液體樣本（如血漿、血清），定量檢測循環(huán)中的NETs衍生成分（稱為“NETomics"）具有無創(chuàng)、可動態(tài)監(jiān)測的優(yōu)勢?；趭A心法ELISA原理，使用捕獲抗體和檢測抗體對血漿中的游離Cit-H3、MPO-DNA復(fù)合物等進(jìn)行定量。然而，血漿中NETs標(biāo)志物的水平受多種因素影響，其標(biāo)準(zhǔn)化和解讀需格外謹(jǐn)慎。

技術(shù)挑戰(zhàn)與解決方案：
NETs檢測的主要挑戰(zhàn)在于其特異性。細(xì)胞死亡時會釋放DNA，但并非所有細(xì)胞外DNA都是NETs。因此，單純使用DNA染料或抗總組蛋白抗體會帶來高背景和假陽性。解決方案就是聯(lián)合使用多種標(biāo)志物，其中Cit-H3是區(qū)分度的指標(biāo)之一。選擇經(jīng)過肽段競爭實驗驗證、且在PAD4敲除或抑制模型中信號消失的高質(zhì)量抗Cit-H3抗體，是實驗成功的關(guān)鍵。

此外，使用細(xì)胞刺激陽性對照（如PMA刺激中性粒細(xì)胞）和陰性對照（如用DNase I處理降解NETs），以及設(shè)置抗體同種型對照，對于確保檢測的特異性至關(guān)重要。

總之，隨著對NETs在血栓性疾病中作用的認(rèn)知不斷深入，對其精準(zhǔn)檢測的需求日益迫切。以高特異性抗Cit-H3抗體為核心的免疫學(xué)檢測技術(shù)組合，為我們提供了在復(fù)雜生物樣本中窺探NETs的強(qiáng)大工具，不僅推動了基礎(chǔ)機(jī)制的探索，也為相關(guān)疾病的診斷和治療策略開發(fā)開辟了新的道路。